体外染色体畸变试验原理、试验设计及常见问题解答
2025-07-04
第一题 染色体畸变实验过程中阅片需要配套什么显微镜，如何操作？
答：染色体畸变试验使用的是正置显微镜，最好在100×油镜下进行观察。先于低倍镜下寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细胞，再于油镜下进行染色体畸变观察并记录。
第二题 如何确定秋水仙素的浓度和处理时间？
答：若秋水仙素剂量大，则作用时间短；秋水仙素剂量小，则适当延长作用时间。本公司使用的秋水仙素浓度是1μg/mL，4h
第三题 如何根据预实验中药物对细胞的毒性选择后续给药剂量，后续给药设置几个浓度梯度？
答：具体难度设置需要参考所属受试物类型的相关标准。当细胞有毒性反应时，最高浓度所产生的细胞毒性应达到约50%，最低浓度应无细胞毒性。后续试验应设至少3个剂量组，组距在2~√10。
第四题 低渗目的是什么？有什么注意事项？
答：在低渗环境中，细胞易吸水膨胀，染色体铺展，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，为后续染色做准备。在低渗过程中我们需要注意以下几点：
（1）低渗时间。低渗时间过长，可引起细胞破裂，染色体丢失；低渗时间不足，细胞膨胀度不够，染色体聚集，分散不好，不利于阅片。本公司低渗是使用0.075mol/L的氯化钾溶液37℃水浴30~40min。
（2） 细胞操作需轻柔。低渗后的细胞会胀大，通透性增强，细胞操作过程一定要轻柔，以防细胞破裂。
（3）离心条件需适合。低渗后细胞膨胀，离心力过高，细胞容易破裂，导致染色体丢失；离心力过低，细胞不能沉淀，收集不到细胞。
第五题 一张拨片可观察到200个中期分裂项吗？如果不够，该怎么处理？
答：大多数情况下，一张玻片很难找到200个可用于分析的中期分裂相，建议同一个剂量组多制作一些玻片，本公司一个剂量组通常会制作至少4张玻片，以保证足够中期分裂相细胞可供分析。
第六题 低渗的温度控制在什么范围内？
答：低渗时可保持温度在37℃左右，此温度下对细胞的影响较小。
第七题 在预实验中需要使用 s9做有活化系统的预实验吗？
答：建议在预实验中加入S9活化系统进行同步检测，判断有或无代谢活化系统条件下受试物对细胞的毒性作用。
第八题 封片怎么操作？
答：长期保存玻片可使用中性树脂胶对染色干燥后的玻片进行封装，操作时可在玻片边缘滴加1-2滴中性树脂胶，再将盖玻片沿滴加位置顺压至整个玻片，过程中保持轻柔，避免残留气泡或过多溢胶，以免影响后续观察。
第九题 CHL细胞鉴定包括哪些方面？合格判定的标准是什么？
答：
（1）功能特性验证?：细胞贴壁成纤维样，倍增时间＜24小时；
（2）纯净度检测?：支原体检测，结果需阴性；
（3）染色体核型鉴定?：检测染色体数目与结构。CHL细胞需保持核型稳定，正常染色体数为25±2条，13条等臂染色体、12条端着丝粒染色体，自发畸变率＜5%。
第十题 细胞毒性预实验有哪些注意事项，MTT结果可以代替吗？
答：细胞毒性预实验需注意同步带上溶剂对照，并建议在染毒结束后进行镜下记录观察，再采用一定方法进行量化。MTT法和CCK-8法都是比较常用的细胞毒性检测试剂，都可用与该实验的细胞毒性判断。
十一题 加活化系统和不加活化系统在畸变结果上有差别吗？差别大吗？
答：添加代谢活化系统（?+S9?）与不添加（?-S9?）可能导致畸变结果的显著差异，具体取决于受试物的代谢特性。+S9系统是模拟哺乳动物肝脏代谢环境，可将前体化合物转化为活性致畸代谢物。?-S9系统则是直接检测受试物本身或其稳定代谢物的遗传毒性。
十二题 为什么选择CHL作为常用细胞而不选择CHO，有哪些区别？
答：CHL和CHO细胞都是大部分指导原则内推荐使用的细胞系，而相较CHO细胞，CHL细胞的染色体数目相对稳定，且目前大多机构使用CHL细胞较多。
十三题 阅片时看不见着丝点染色体，都成单条染色体成对出现，这是为什么哪个步骤出现了问题？
答：出现此结果的主要原因是未将细胞终止在有丝分裂中期，而是到了有丝分裂后期。可能是秋水仙素的作用时机稍晚或作用浓度过低所致，有丝分裂后期表现为着丝粒分裂，姐妹染色单体分离成独立染色体，呈现“单条成对”向两极移动。
十四题 CHL细胞作为实验系统细胞准备时推荐的接种密度多大，接种后培养多久时间可以开始进行染毒？
答：本公司使用T25瓶进行试验，接种密度为6~9×10^4/mL，接种量为5mL，即每瓶细胞量是3×10^5个~4.5×10^5个。一般情况下，接种后24h左右细胞的融合率可达到80%即可进行染毒，如果融合率不够，也可以继续培养直至满足试验需求。
十五题 制片过程中离心后有黑色渣渣出现，最后滴出来的片没有染色体，但是有很多细胞圈，是什么原因？
答：有黑色渣渣出现可能原因包括
（1）细胞碎片过度堆积?：组织消化不彻底或低渗处理时间过长（>30分钟），导致细胞膜破裂释放大量碎片，离心后形成黑色絮状物。
（2）?固定剂残留或变质?：甲醇-冰醋酸固定液比例错误（标准3:1）或陈旧固定液产生沉淀物，与细胞碎片结合呈黑色颗粒。
滴出来的片没有染色体，但是有很多细胞圈的主要原因是细胞未被终止在有丝分裂中期，可能已完成细胞有丝分裂。
十六题 玻片想要长期保存，需要如何处理？
答：要长期保存玻片，需正确使用中性树脂胶对玻片进行封装，后续密封放置于阴凉处，可保存数年。
十七题 受试物容易析出结晶，难以溶解，最大溶解度的细胞毒性达不到50%。这种情况如何设置浓度？
答：在染色体畸变试验中，受试物溶解性差且最大溶解度下细胞毒性不足50%时，需结合对应指导原则采取措施。当观察到肉眼可见的沉淀时，可放弃50%细胞毒性的硬性要求。同时试验允许使用1个含可见沉淀的浓度?，但需确保沉淀不覆盖细胞层或干扰显微镜观察；沉淀在培养液中分布均匀，避免局部高浓度损伤。?
十八题 请描述一下畸变类型粉碎性的染色体。
答：“粉碎性的染色体”可能由于低渗时间过久、滴片位置较高、重悬操作用力过度所致，细胞膜破裂，导致内部染色体被释放至外部分散存在。
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