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IPHASE/汇智和源 Ames试验常见问题与解答
2025-03-28
第一题 空白对照是否必须要做？
答：是的，空白对照组，即未处理对照组，是用于评估菌株自发回复突变菌落数量；另外，和阳性对照组结合用于试验结果有效性的判定。
第二题 实验中，会出现加 s9比减 s9菌落总数长得少/多，是什么原因？
答：（1）加S9组比减S9组菌落数少，有可能是S9代谢活化系统中有诱导性残留，并且诱导剂具有一定的细菌毒性。
（2）加S9组比减S9组菌落数多，这种情况属正常现象，但即使偏高也会在国标或导则的要求范围内；可能是因为肝S9本身有痕量的氨基酸成分，可为菌株提供营养。
第三题 实验时，用蒸馏水和纯化水有区别吗？
答：国标中是使用蒸馏水进行培养基的配制，我们也是遵循国标的要求，暂未对比过蒸馏水和纯化水的区别。
第四题 s9中会有诱导剂残留吗？
答：我司诱导S9制备后会进行无菌鉴定、蛋白浓度测定、酶活测定、Ames试验鉴定等，结果均符合要求，暂未检测过是否有诱导剂残留。
第五题 预实验中细菌回复突变菌落数减少多少，算有细菌毒性？
答：（1）回复突变菌落数与溶剂对照组相比，减少50%以上，且具有剂量效应关系；
（2）与溶剂对照组相比，背景菌苔显著减少或消失；
（3）当化合物细胞毒性极大时(背景菌苔完全消失)，在高剂量组中可能会出现数量众多的针尖样菌落。这些针尖样菌落不是回复突变菌落，该平皿不应计数。
第六题 试验组中 SD 值过大一般是什么原因导致的？
答：三次平行重复间SD值过大可能由操作误差、样本处理不均（菌液、S9、受试物或标准诱变剂）、平板计数误差等因素引起，我们在进行试验时需确保所有平行样品的处理步骤（如加样体积、反应时间、温度控制等）完全一致，样本需混合均匀，这样能避免三次平行重复间的SD值过大。
第七题 加入 s9之后菌落不生长是什么原因？
答：如果其他不加S9组的菌落数正常，加S9组菌落不生长，有可能是S9中残留的诱导剂对于细菌具有毒性。
第八题 标准中规定用十的九次方的菌液进行实验，如何确定菌液浓度是十的九次方？
答：一般采用测定菌液在600nm处的吸光度值（OD600）和平板计数法结合来测定菌液的浓度。
第九题 预实验背景菌台无变化，回复突变数减少是否可以算是细菌毒性？
答：是的，如果回复突变菌落数与溶剂对照组相比，减少50%以上，且具有剂量效应关系，则表面受试物是具有细菌毒性的。
第十题 Ta98在扩增冻存后变得不稳定，有一层白色背景，影响菌落计数，是什么原因？
答： 我们暂时没有遇到过该情况，您可以查一下相关的资料，我们也同其他客户沟通一下，看看其他客户有没有遇到过类似的情况。
十一题 为何Pm101菌株，菌落数做的时候有的时候大有的时候小？
答：我们也遇到过类似的情况，PKM101的菌落体积大小不一致，这是正常的，只要菌落数在国标或者导则要求范围内就可以。
十二题 阳性物自发回变数少是什么原因？
答：阳性对照组细菌回复突变菌落数少，有可能的原因是：（1）阳性底物溶解不彻底或未充分混匀；（2）阳性底物添加量偏少；（3）试剂盒保存条件不合适或过期，标准诱变剂降解或 S9失活；（4）操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高。
十三题 预孵化体系和平板掺入法所用的阳性药物是否有区别？
答：没有区别，二者所用的阳性药物是一样的。
十四题 要开展Ames试验，如何选择溶媒/赋形剂？
答：不同剂量浓度样品的制备是开展Ames试验的前提，制备符合试验要求的样品也有一些行业要求需要遵守。第一,溶媒/赋形剂的选择原则是其不与受试物发生反应，对菌株和S9没有毒性，没有诱变性；第二，首选蒸馏水，对于不溶于水的受试物可选择其它溶媒/赋形剂，若受试物对水不稳定，应选用不含水的有机溶剂或赋形剂；第三，若选用有机溶剂作为溶媒，首选DMSO，也可选其它溶媒，若选用的是不常用的溶媒或赋形剂，应有资料说明其理由，且若选用有机溶剂做为溶媒，每平板最高添加量不超过0.1mL。
十五题 Ames试验的最高剂量组应如何确定？
答：Ames试验最高剂量组的确定取决于受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。建议先进行预实验测定受试样品的毒性和溶解度，应根据受试样品对细菌的毒性和在配制的最终混合物种的溶解度确定受试样品的最高剂量组。可将回变菌落数的减少、背景菌苔体积变小或处理后细菌存活率降低等作为细菌毒性的指征。
十六题 Ames试验组别如何设置？
答：Ames试验通常需要包含未处理对照组（自发对照组）、阳性对照组（标准诱变剂对照组）溶媒对照组和样品剂量组四个组别的试验。需要注意的是，若溶解样品使用的溶媒和标准诱变剂使用的溶媒不一致时，还需加做DMSO的对照，且样品剂量组数量不同领域的要求会存在一定差异，需关注具体参照的标准或导则。
十七题 为什么要在有和没有代谢活化系统的情况下试验？
答：代谢活化系统是诱导S9和辅因子的混合溶液。诱导S9本身是经药物诱导后的动物肝脏的组分，诱导的目的是让酶活得以放大。加代谢活化系统组评估的是代谢产物的遗传毒性，而不加代谢活化系统组评估的是原药的遗传毒性。对于未知化合物，因不确定是其自身，还是其代谢产物会有遗传毒性，故需在这两种情况下同时进行试验。
十八题 Ames试剂盒可以检测几个样品？
答：Ames试剂盒可完成一个样品的Ames检测。Ames试剂盒（5菌版/正式试验）规格为250皿/盒，可在有和无代谢活化系统、5个菌株、三个平行的情况下进行对照组（未处理对照组、溶媒对照组、阳性对照组）和样品的5个剂量组的遗传毒性检测；Ames试剂盒（2菌版/预实验）规格为150皿/盒，可在有和无代谢活化系统、2个菌株、三个平行的情况下进行对照组（未处理对照组、溶媒对照组、阳性对照组）和样品的8个剂量组的遗传毒性检测；微量波动Ames试剂盒的规格我96孔*16板，可在有和无代谢活化系统、2个菌株、48孔/处理组的情况下进行对照组（未处理对照组、溶媒对照组、阳性对照组）和样品的5个剂量组的遗传毒性检测。
十九题 试剂盒中菌株可不可以传代培养？
答：不建议对试剂盒中的菌株进行传代培养。原因主要有以下三点：第一，Ames试剂盒中菌株是以冻存菌液形式提供，可满足Ames试验要求，收到货后无需进行其它处理，可直接用于试验；第二，因Ames试剂盒中菌株均为营养缺陷型菌株，频繁处理可能使得其某些特性丢失；第三，Ames试验对菌株不但有浓度的要求，而且有自发和阳性突变菌落数的要求，国标或指导原则中虽然写的较为简单，但真正要达到其要求却很难。
二十题 Ames试剂盒是否可分多次去使用？
答：Ames试剂盒试剂盒中菌株和S9复合物不建议反复冻融使用，如需分次多次试验，建议按照菌株分次进行。Ames试剂盒中菌株为营养缺陷型菌株，且以冻存菌液形式提供，反复冻融一方面可能会导致其某些特性丢失，另一方面也会直接导致自发回变数和阳性诱变剂回变数达不到标准或指导原则要求。S9复合物在Ames试验中是作为代谢活化系统，而发生代谢主要是酶的参与，反复冻融会导致酶活降低，可能会导致试验结果的假阴性。
二十一题 当受试物（如某些抗生素）对细菌有高毒性时是否还需进行Ames试验？有没有其它验证方法？
答：当受试物对细菌有高毒性时，仍应进行Ames试验，因为致突变性可能出现在较低的、毒性较小的浓度。为了减少具有潜在遗传毒性的化合物产生假阴性结果的风险，遗传毒性的研究通常需要多个试验的组合。任何一项遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明化合物对人类真正具有遗传毒性或致癌性的危险。故可以加做其它试验，如基因突变试验、染色体畸变试验。
二十二题 在实验的过程中，可能会因为化合物的溶解性不好，导致无法区分是菌落还是沉淀，该如何处理？
答：常规的要求是平皿中可以有未溶解的化合物，但是沉淀的存在不能影响到菌落计数。若这种情况无法避免，可以培养48h后先进行一次菌落观察和计数，并继续培养至72h，若生长则可判定为菌落，也可挑取菌落接种至培养基培养观察是否生长。
二十三题 试验过程中加S9组比不加S9组菌落数要高，是否正常？
答：这种情况属正常现象，但即使偏高也会在国标或导则的要求范围内。可能是因为肝S9本身有痕量的氨基酸成分，可为会菌提供营养。
二十四题 受试物浓度低未检出遗传毒性还是本身无遗传毒性？该如何判断？
答：一方面，Ames试验的要求是，若试验结果为阴性，需进行验证，即需改变试验条件进行重复试验。另一方面，为了减少假阴性结果的风险，遗传毒性的研究通常需要多个试验的组合，可补做基因突变、染色体畸变、微核等其它试验。
二十五题 医疗器械：浸提溶剂为什么选择水？按照标准应该选择生理盐水或DMSO。
答：关于医疗器械的浸提属于样品前处理的过程，试剂盒中未提供，需自行进行准备。试剂盒适用于多个领域的Ames检测，具体到每个领域，可能会有一定差异。
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